Николаус и др. исследовали также разделение тетрациклинов на тонких слоях силикагеля G. Они изучили большое число растворителей; четыре лучших растворителя указаны в табл. 1.2, там же даны соответствующие величины Rf. В дополнение к приведенным в таблице результатам следует указать, что окситетрациклин и диметилтетрациклин можно отделить от тетрациклина, хлортетрациклина и дезокситетрациклина, элюируя смесь 10 %-ным раствором лимонной кислоты, насыщенным бутанолом. Обнаруживают тетрациклины, опрыскивая пластинки 1 н. соляной кислотой и затем нагревая их при 50 °С. Тетрациклины обнаруживают в виде желтых пятен. Для обнаружения дезокситетрациклина используют реакцию сочетания с солью диазония. При проведении микробиологической пробы агар заражают Bacterium subtilis.
Таблица 2.1
Величины Rf X 100 некоторых тетрациклинов, полученные с различными хроматографическими системами
|
Соединение |
Силикагель |
Кизельгур | |||||
|
А |
Б |
В |
Г |
Д |
Е |
Ж | |
|
Тетрациклин Хлортетрациклин Ангидротетрациклин Окситетрациклин Ангидрохлортетрациклин Диметилхлортетрациклин Метациклин Доксициклин 4-Эпитетрациклин Эпиангидротетрациклин 4-Эпихлортетрациклин |
36 30 0-20 58 0-20 |
38 43 45 41 46 |
61 72 68 70 75 |
50 60 50 55 52 |
53 76 93 60 83 73 44 53 20 47 33 |
36 60 83 20 57 44 29 27 12 50 21 |
Ро Ро Ро Ж Ро Ро Ро-Ко Ро-Ко Ж Ж-Ро Ж-Ро |
Авторы работы разделяли тетрациклин, хлортетрациклин, диметилхлортетрациклин и их ангидро- и эпипроизводные на промытом кислотой кизельгуре G, пропитанном 20 %-ным раствором полиэтиленоксидгликоля 400 в смеси глицерин — 0,1 М ЭДТА при рН 7 (1 : 19). Разделяющим растворителем был органический слой смеси этилацетат — 0,1 М ЭДТА, рН 7 (6:1). При рассмотрении пластинок в длинноволновом УФ-свете можно обнаружить 0,05 мкг антибиотика. В работе описана методика разделения тетрациклинов и продуктов их превращения на кизельгуре, пропитанном ЭДТА; величины Rf и применявшиеся растворители указаны в табл. 1.2.
Количественное определение ангидротетрациклинов в разложившихся таблетках тетрациклина проводили, экстрагируя зоны ТСХ и измеряя коэффициент поглощения при 428 нм . При определении эпитетрациклина и хлортетрациклина зону первого соскребали, элюировали 0,1 н. соляной кислотой и измеряли поглощение элюента при 356 нм. Хлортетрациклин после элюирования 0,2 н. гидроксидом натрия измеряли по интенсивности флуоресценции в области 414 нм (длина возбуждающего излучения 356 нм). Радека и Вильсон проводили определение тетрациклина в фармацевтических препаратах in situ. Хотя этот метод менее точен, чем спектрофотометрический метод Альварца Фернандеца и др., он более чувствителен, требует меньше времени и более точен, чем официальные микробиологические методы. Ван Хоек и др. разработали для этой группы соединений флуорометрический метод определения in situ.